在这项研究中，Evonetix公司和 Scienion公司合作开发了一种在硅半导体芯片上进行高度并进行DNA 合成的可扩展工艺。利用 Scienon 的精密点样技术，在 Evonetix的 DNA合成平台上点样了一个启动DNA合成的链接物 ,直径为100微米的金点。研究结果表明，链接物可以精确地放置在反应点上，从而最大限度地减少溢出，并最大限度地减少相邻 DNA 序列之间的串扰。Evonetix 在 DNA 合成研究中成功证明了涂层芯片的功能。
Evonetix公司是一家总部位于剑桥的公司，致力于开发新型半导体技术，以大规模生成高保真度的DNA。
这款桌面DNA合成平台提供了前所未有的精确度、规模和速度进行DNA合成的能力。
DNA合成在半导体芯片上实现的独立温控反应点位上进行（图 1）。
在反应位点上沉积一层薄薄的金属层，下一步将使用内部开发的基底涂层对其进行功能化处理。
该涂层可实现与金属点的共价结合，随后固定连接体。连接体带有一个活性头基的分子，用于结合第一个磷酰胺酸二酯，启动单链DNA合成。芯片本身被组装到一块印刷电路板中。芯片顶部有一个流体室。
图1:打印电路板（左）上装有独立温控反应点（右）的组装半导体芯片。
Scienion GmbH 是一家提供完整解决方案的公司，
专注于开发和制造用于诊断和其他生命科学领域的微型化多重检测。
Scienion 公司的核心技术基于皮升和纳升范围内的非接触点样，起点为 10 pL/滴。除了仪器和耗材，Scienion 还提供一系列定制开发和制造服务。在本应用说明中，我们进行了原理验证 (POP) 研究，以了解 Evonetix 半导体芯片上的点样工艺技术。
最后，Scienion的点样技术成功应用于功能化Evonetix的DNA合成平台。
因此，在已预先预涂的100微米大的金反应位点上分配了一个连接物，以启动半导体芯片上的DNA合成。
图2（左）本研究中使用的集成了sciDROP PICO 技术的 sciFLEXARRAYER SX 精密点样仪。(右图）sciFLEXARRAYER SX 的点样装置放大图。
包括:(1)压电点样毛细管;(2)点样后用于对目标成像的垂直摄像头;(3)用于可视化和量化滴液参数的高分辨率摄像头。
初步研究
首先，利用 Scienion 的定制开发服务，进行了一项初步研究,以了解芯片表面、滴液量和斑点直径之间的相互作用。
表面润湿性对光斑直径的影响
为了估算覆盖 Evonetix 芯片上 100 µm 直径金反应位点所需的滴液体积，使用 Scienion 的精密点样技术将不同体积（80 - 320 pL）的水滴点样到不同的目标上。通过垂直摄像头拍摄沉积的滴液（斑点）的照片，并通过 sciFLEX 软件分析它们的直径。此外，还对相关支撑材料进行了水接触角测量，以分析它们的润湿性质。最后，还评估了润湿性质对斑点直径的影响。
作为研究的主要支持物，使用未涂层的金基片（CA：96°）和基底涂层金基片（CA：95°）来模拟金位点。这两种载玻片均由 Evonetix 公司提供。为了进行比较，另外使用了sciCHIP H2（CA：106°）和sciCHIP Epoxy（CA：53°）载玻片作为额外的参考表面。
图 3：sciCHIP H2、sciCHIP Epoxy 涂层金片和基底涂层金芯片的液滴斑点直径（y 轴）与喷点量（x 轴）的关系。
不同缓冲条件对斑点形成（斑点大小）的影响
Evonetix的半导体芯片上直径100 µm的反应位点需要覆盖DNA连接剂。我们研究了三种缓冲液中哪种最适合将 DNA 连接固定在预涂覆的金位点上。此外，将滴液量在200 pL和3200 pL之间变化，以评估最佳分配体积。检测在涂有金的载玻片上进行，以研究缓冲液组成和滴液量对斑点形成的影响。
以 200 pL/滴/轮的顺序分配 200 - 3200 pL/斑点，轮次之间等待时间为2分钟。每个序列后测量斑点直径（图4）。使用了Evonetix提供的Evx缓冲液和Scienion提供的sciSPOT B2作为缓冲试剂。此外，Evx缓冲液与sciSPOT B2混合，结合了两种缓冲液的特性。
图 4：在涂层金片上依次喷点Evx缓冲液、sciSPOT B2缓冲液及它们的混合物后获得的斑点直径（每轮200 pL）。
使用Evx 缓冲液时，分配200 pL 时，光斑直径为 98 ± 2 µm，分配 400 pL 时，光斑直径为 127 ± 3 µm。沉积 800 pL 后，每多沉积一轮，光斑直径增加不到 10%。使用sciSPOT B2 缓冲液时，200 pL 的直径为 102 ± 2 µm，400 pL 的直径为 115 ± 5 µm。每增加一轮点样，光斑直径几乎线性增加 5-13%。使用Evx 缓冲液 + sciSPOT B2 缓冲液时，200 pL 的光斑直径为 79 ± 3 µm，400 pL 的光斑直径为 110 ± 2 µm。
在 200 - 800 pL（增加 40-47%）和 800 - 3200 pL（增加 4-13%）之间，光斑直径几乎呈线性增长(增加 4-13%）。
覆盖 100 µm 图层金表面所需的体积约为 200 pL。所有测试的三种缓冲液都能覆盖目标的光斑直径。我们决定使用Evx 缓冲液 + sciSPOT B2 缓冲液 的组合特性来沉积 DNA 连接体，以达到最佳固定效果。
利用 Scienion 的精密点样技术实现 Evonetix 芯片的功能化
Evonetix的芯片具有独立温度控制的反应位点，在Scienion处进行了基底涂层的功能化处理。芯片被组装到芯片载体中，连接到流体夹具上，进行清洗，并根据Evonetix提供的方案进行反应性和热稳定性涂层的功能化处理。在接下来的步骤中，带有芯片的载体被放置在sciFLEXARRAYER SX的靶板上（见图5）。靶板冷却至8°C，相对湿度设定为65%。
图 5：四个装有涂层芯片的 Kinabalu 芯片载体被放置在 sciFLEXARRAYER SX 的目标平台上。
作为试剂，ssDNA-Cy5 和一个连接物被打印在反应位点上。第一种试剂用作阳性对照，而第二种试剂可在随后的合成过程中固定第一个 DNA 碱基。大约需要200pL试剂才能覆盖直径为100µm 的反应位点，确保不会溢出到相邻区域（图6），这验证了在不同缓冲液条件下的初步研究结果。
(a)201pL/drop of linker in phosphate buffer
201 pL/滴磷酸盐缓冲液中的连接体。
(b) 204 pL/drop of ssDNA-Cy5 in Evx buffer +sciSPOT B2 mix204 pL/滴ssDNA-Cy5，Evx 缓冲溶液 +sciSPOT B2 混合液。
图6：通过 sciFLEXARRAYER SX的水平摄像头拍摄的200 pL水平图像。
芯片上的反应位点按三个区域排列，每个区域有3x3个反应点。
每个区域内的反应点之间的间距为400微米（双向），区域之间的间距为2800微米。
在点样过程中，每个区域的 3/3 位点留空，ssDNA-Cy5 沉积在 2/2 位点（中心点）。
连接物被沉积在其余位点上（图7）。
图7:阵列布局:空位图像（3/3 位置）、阳性对照 ssDNA（2/2 位置）和连接物（其余位置）沉积在涂金反应位点上。
试剂按两轮顺序预埋：先喷 200 pL 试剂，5 分钟后再在每个部位沉积 200pL相同的试剂，以增加试剂的累积量。最终的平均光斑直径为 120 µm ± 10 µm，这表明溢出极少。沉积完成后，芯片在相对湿度为 70% 的室温下培养过夜。剩余的试剂通过清洗程序从表面清除。
ssDNA被合成在所有连接功能化的金位点上（阳性对照的2/2位和空位3/3除外），并与 ROX 标记的互补 ssDNA 杂交。使用 Leica DMi8 荧光显微镜观察 ROX 标记的 ssDNA 的荧光图像表明，在先前连接功能化的反应位点上成功合成了目标 ssDNA（图 8a）。测得的荧光强度为 5715 ± 395 RFU，是 3/3 位置未功能化反应位点（1130 ± 90 RFU）的 5 倍。阳性对照ssDNA-Cy5在2/2位置的荧光强度比未涂层的反应位点高出9倍（阳性位点：17117 ± 4248 RFU；未涂点的对照位点：1911 ± 87 RFU）。
图 8：使用 Leica DMi8 荧光显微镜在同一芯片上拍摄的荧光图像（a）ROX 标记的辅助 ssDNA 与合成在连接器功能化位点上的ssDNA杂交后的图像（LED 激发 560 纳米，发射滤光片 592-668 纳米，5 倍放大镜）
b）阳性对照的荧光图像（LED 激发 635 纳米，发射滤光片 666-724 纳米，5 倍放大镜）。随后的研究中，我们在金位点上沉积了3滴连接剂，
以研究固定连接剂的密度如何影响ssDNA的合成量：2滴、6滴和 8滴（每滴 200 pl）。
与ROX标记的互补ssDNA杂交后，拍摄荧光图像（Leica DMi8荧光显微镜）并测量荧光强度（图 9）。
可以得出的结论是，随着固定的连接剂的增加，荧光强度也随之增加，合成的ssDNA量也随之增加。
6滴/点的沉积导致荧光强度：
- 与沉积2滴连接剂后的荧光强度相比几乎高出3倍
- 与沉积8滴/点连接剂后获得的荧光强度相比处于同一数量级。
结论
Scienion的精密点样技术成功应用于Evonetix开发的DNA合成平台的100微米大金位点的功能化。
我们对不同的点样参数（包括缓冲液和连接剂浓度）进行了评估，以确定DNA合成的最佳参数。
我们能够证明，在同一反应位点上点样 2-3 滴（200 pL）连接剂会导致信号增加。点样六滴足以使点样区域的反应位点达到饱和，超过饱和后，信号不再增加。
