基因编辑是一项革命性的技术，但其脱靶效应一直是科学家对CRISPR-Cas临床应用的担忧。基因编辑可能导致在脱靶位点发生小片段的插入缺失，还有可能在在靶位点发生意外的大片段删除或染色体倒位、易位。染色体重排异位非传统意义的脱靶，但是可造成染色体剧烈改变，引起严重的毒副反应。美国FDA对基因治疗产品的指导原则《Human Gene Therapy Products IncorporatingHuman Genome Editing》里明确指出，临床基因治疗需要评估脱靶导致的染色体易位。
图1: FDA关于染色体重排的指导原则
在此，舒桐科技小编向大家介绍一种新的染色体重排检测技术——Primer extension-mediated sequencing (PEM-seq) ,它可以全面、精确量化基因编辑的双链断裂（DSB）后DNA的修复结果。
PEM-seq的实验设计非常巧妙，通过在DSB上游设计引物（称为诱饵primer），捕获下游与DSB位点DNA修复后连接的序列（称为猎物序列）。与其他脱靶分析技术相比，PEM-seq的优势在于它可以检测到在靶位点的小片段和大片段的插入缺失（indel），以及由脱靶导致染色体易位。PEM-seq的详细的实验步骤如下图2。
图2 PEM-seq实验原理。
首先，PEM-seq可以得到在靶indel的编辑效率，并且与公认的扩增子编辑分析软件CRISPResso结果相关性达到0.99，如下图3。
图3 在靶位点小片段插入缺失分布和与CRISPResso对比。来源：Nucleic acids research 49.15 (2021): 8732-8742.
其次，PEM-seq通过捕获还可以得到大片段的插入（>=20bp）和删除（>=100bp）信息，这是常规扩增子无法得到的。如下图4、5。
图4 在靶位点大片段插入分布。来源：Nucleic acids research 49.15 (2021): 8732-8742.
图5 在靶位点大片段删除分布。来源：Nucleic acids research 49.15 (2021): 8732-8742.
更进一步，如果捕获到的猎物序列距离DSB位点>500kb，那么这些位点则是易位产生的，诱饵Primer捕获到的基因组易位位点通过下面的Circos图展示。通过筛选易位位点与sgRNA同源序列，即可得到脱靶位点。如图6，SpCas9，在基因组易位位点中共发现了7个脱靶导致的易位，而AsCas12a没有检测到脱靶导致的易位。
图6 诱饵Primer捕获到的易位位点（外圈），以及脱靶易位位点（内圈为在靶和脱靶位点连线）。来源：Nature Communications 13.1 (2022): 5623.
目前，PEM-seq已应用于描绘Cas12家族的编辑产物的特征，该技术实现了对基因编辑的全面、高精度定量的安全性评估，在分析基因编辑的大片段插入、删除、易位展现了独特的优势。因此，PEM-seq有望成为基因编辑领域的标准化脱靶分析技术，并为新型基因编辑工具临床应用提供前瞻性指导。
PEM-seq科研服务
舒桐科技跟踪最新前沿进展，配合资深研发团队现已推出PEM-seq实验和分析服务，服务详情可见舒桐科技官网。
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参考文献：
1.Liu, Mengzhu, et al. "Global detection of DNA repair outcomes induced by CRISPR–Cas9." Nucleic acids research 49.15 (2021): 8732-8742.
2. Xin, Changchang, et al. "Comprehensive assessment of miniature CRISPR-Cas12f nucleases for gene disruption." Nature Communications 13.1 (2022): 5623.