CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一种新型DNA-蛋白互作研究技术，主要用于研究转录因子或组蛋白修饰在全基因组上的结合位点。CUT&Tag的核心原理是利用抗体识别目标蛋白或特定的染色质修饰标记，并通过蛋白酶Tn5转座酶（Tagmentase）在目标位点上进行高效的DNA片段化和文库构建。Stephen Henikoff团队于2019年研发了CUT&Tag，作为ChIP-Seq（免疫共沉淀测序）的改进和替代方法。CUT&Tag技术凭借其高灵敏度、低背景噪音和低细胞量需求，已成为揭示基因调控机制、解析染色质状态和推动精准医学研究的重要工具，并广泛应用于表观遗传学研究、转录因子结合位点分析、疾病机制解析、药物筛选与作用机制探索以及单细胞水平的基因调控研究等多领域。依托先进的Protein A/G-Tn5融合蛋白体系和高通量测序平台，百泰派克生物科技提供专业的CUT&Tag技术服务，覆盖样本制备、文库构建、高通量测序及生物信息学分析全流程。我们的技术团队具备丰富的表观基因组学经验，能够高效、精准地解析蛋白质与DNA的相互作用，助力科研人员揭示基因调控的深层机制。
一、CUT&Tag技术背景
组蛋白通过形成核小体压实和保护DNA，其修饰（如乙酰化、甲基化）与DNA甲基化共同调控基因表达，其修饰状态和动态变化对于细胞功能的维持至关重要，也与多种疾病的发生发展密切相关。因此，理解组蛋白与 DNA 之间复杂而精密的相互作用，对于揭示正常细胞过程和疾病状态，尤其是癌症，具有重要的科学和临床意义。此外，蛋白质-DNA相互作用是基因转录调控的核心，也是启动基因转录的前提。为了研究这些复杂的相互作用机制，科学家开发了多种方法，包括凝胶阻滞、DNaseⅠ足迹实验、甲基化干扰、体内足迹、酵母双杂交、ChIP-Seq 和 CUT&Tag 等。其中，CUT&Tag技术正逐步成为研究蛋白质-DNA相互作用和染色质状态的前沿。
二、CUT&Tag与ChIP-Seq技术比对
CHIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），结合位点分析法/染色质免疫共沉淀，其原理是通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。通过将获得的数百万条序列精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。然而，该技术存在细胞起始量要求高、容易出现假阴性/假阳性、超声打断条件难以选择、高度依赖特异性抗体、重复性差、信噪比低等缺陷。
CUT&Tag使用ProteinA/G-Tn5融合蛋白直接结合目标蛋白，免除了传统方法的交联步骤，大幅降低背景噪声，并实现高分辨率的结合位点检测。CUT&Tag技术流程包括以下关键步骤：首先，使用ConA磁珠结合细胞膜上的糖蛋白，提取细胞核或直接利用核样本，同时通过洋地黄皂苷（digitonin）透化细胞膜，增强核膜通透性。接着，加入特异性一抗（如α-H3K27me3）孵育并洗涤去除非特异性结合，再加入二抗确保抗体复合物精准结合靶标区域。随后，Protein A/G-Tn5融合蛋白与抗体复合物结合，将Tn5转座酶精准定位到目标DNA区域。通过加入含Mg²⁺的反应液激活Tn5酶，实现DNA片段化并插入测序接头，完成文库构建。最终，利用Illumina平台进行高通量测序，结合生物信息学工具进行质控、基因组比对、富集峰注释、Motif识别、GO功能分析及KEGG通路分析，全面解析转录因子结合位点及染色质修饰的功能作用。
图1. 技术路线比对 Plant Methods 16, 120 (2020)
图2
三、CUT&Tag技术亮点
1、低细胞量需求：仅需少量细胞（甚至单细胞水平）即可进行分析。
2、高灵敏度：背景噪声低，信噪比高。
3、高分辨率：可清晰定位到转录因子和组蛋白修饰的结合区域
4、实验周期短：相较于ChIP-Seq，实验流程更加简单，时间更短。
四、CUT&Tag文献应用
——CUT&Tag揭示H3K18la对PDAC（胰腺导管腺癌）发生发展调控机制
图3
胰腺癌是一种高度侵袭性的消化系统肿瘤，是人类最致命的恶性肿瘤，5年总生存率较低，其中80%以上为胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma， PDAC）。尽管在过去十年中试图改善其治疗，但PDAC的死亡率并没有大幅下降。因此，更清晰地了解PDAC的生长和转移机制，寻找潜在的治疗靶点和新的生物标志物来预测PDAC的预后势在必行。PDAC细胞利用“代谢重编程”来支持恶性行为，如快速增殖、侵袭和一些细胞过程。糖酵解增强和乳酸积累是各种类型癌症的共同特征。然而，代谢重编程如何重塑表观遗传改变，特别是PDAC中的乳酸化，仍不清楚。为此，北京大学第三医院利用CUT&Tag技术展开研究并发表“糖酵解和组蛋白乳酸化之间的正反馈调节驱动胰腺导管腺癌的发生”一文，阐述了其主要研究成果：
1、组蛋白乳酸化水平升高与PDAC患者的不良预后相关
（1）在PDAC患者胰腺组织中，乳酸含量高于正常邻近组织（图A）。同样，MIA PaCa-2、PANC-1、AsPC-1和PL45等PDAC细胞系的乳酸产量也高于人胰腺导管上皮细胞系hTERT-HPNE（图B）。使用非靶向代谢组学分析了PDAC患者和健康组血清样本中代谢物的变化。结果显示，肿瘤组和健康组之间有222种代谢物存在显著差异，肿瘤组中有100种代谢物较低，122种代谢物较高，图C)。不同血清代谢物的KEGG分析显示中心碳代谢富集（图D）。尤其值得注意的是，乳酸也是代谢产物之一。
（2）由于产生大量乳酸作为组蛋白乳酸化的底物，检测了5对PDAC组织和周围非癌组织的蛋白质乳酸化水平。在PDAC组织中观察到更高水平的全局/泛赖氨酸乳酸化（Pan Kla）（图E）。由于组蛋白修饰在大多数生物学过程中发挥着基础作用，H3K18la已被报道调节多种生物学过程，如肿瘤发生，因此重点研究了其表达和功能。一致地，H3K18la水平在PDAC组织中也升高（图E）。此外，与正常胰腺导管上皮细胞系相比，4种PDAC细胞系中Pan Kla和H3K18la的表达均显著上调（图F）。
图4
（3）接下来，对74例PDAC组织和72例癌旁组织（90对组织排除脱落切片、无胰管组织和形态明显异常的癌旁组织）进行免疫组化染色，评估H3K18la的临床意义。如图G和H所示，与正常组织相比，PDAC中H3K18la水平明显上调。在PDAC患者中，51.4%的样本显示高H3K18la水平，比正常组普遍存在（图I）。H3K18la水平的升高与AJCC的晚期呈正相关（图J）。为了进一步确定H3K18la的预后价值，采用基于H3K18la水平的Kaplan-Meier生存图评估总生存率，通过Log-rank检验确定H3K18la可能与预后相关（图K）。
图5
2、糖酵解抑制减少组蛋白乳酸化，抑制PDAC细胞增殖和迁移
（1）为了明确糖酵解对组蛋白乳酸化的影响，使用不同种类的糖酵解抑制剂（DCA、Oxamate和2-DG），分别在MIA的PaCa-2和AsPC-1细胞中进行LDHA（催化丙酮酸转化为乳酸）的敲低。随着抑制剂剂量的增加，Pan Kla和H3K18la的水平持续降低。此外，si-LDHA有效降低了组蛋白乳酸化水平，Nala（乳酸盐）治疗后组蛋白乳酸化水平显著升高。
（2）随后，研究了组蛋白乳酸化对细胞增殖的生物学功能。观察到用DCA、Oxamate或2-DG处理后，细胞活力和集落形成能力显著下降。此外，LDHA沉默对MIA PaCa-2和AsPC-1细胞的生长和集落形成均有明显的抑制作用，而Nala则减弱了LDHA沉默对细胞增殖的抑制作用。
（3）这些发现表明组蛋白乳酸化在PDAC的起始和进展中起着至关重要的作用，而抑制组蛋白乳酸化可能对PDAC具有潜在的抗肿瘤活性。
3、H3K18la在PDAC中激活TTK和BUB1B转录
（1）接下来，试图确定H3K18la如何影响PDAC进展。使用抗H3K18la抗体进行了CUT&Tag检测。在处理组中，转录起始位点（TSS）区域明显减少（图A和B），在启动子区域观察到约53%的富集（图C）。对处理组中特异性启动子区域下调峰的KEGG分析显示，RNA转运途径、细胞周期和肿瘤相关途径（如MAPK信号通路）中有相关的富集（图D）。
（2）此外，通过RNA-seq检测筛选乳酸化调控的潜在靶基因。与对照组相比，在PDAC细胞中，Oxamate处理上调了1259个基因，下调了303个基因（图E）。对这些下调基因的KEGG分析也显示，在Oxamate处理组中，细胞周期通路中富集（图F）。CUT&Tag的基因本体（GO）分析和RNA-seq分析也显示在细胞周期相关过程中富集。
（3）结合CUT&Tag、RNA-seq数据和GEPIA数据库，该研究筛选出14个在PDAC中高表达且受H3K18la调控的基因，这些基因与细胞周期进程紧密相关。利用ChIP-qPCR验证了H3K18la在TTK和BUB1B启动子区的减少与糖酵解抑制剂使用相关，同时糖酵解抑制剂能下调这两基因的mRNA和蛋白水平，揭示H3K18la通过糖酵解途径调控它们的表达，影响PDAC进程。
图6
研究表明，CUT&Tag广泛应用于研究特定的染色质修饰（如H3K27me3、H3K4me1等）在基因组上的分布。通过CUT&Tag，可以清晰地揭示不同染色质修饰标记在基因组上的定位，帮助理解基因调控的表观遗传机制。除此之外，CUT&Tag在其他研究领域也不可或缺。在转录因子结合位点鉴定方面，CUT&Tag能够精确鉴定转录因子在基因组上的结合位点，揭示其在基因表达调控中的作用。在单细胞表观组学中，由于CUT&Tag技术对样本量的需求极低，单细胞CUT&Tag能够揭示细胞群体中个体细胞的异质性及染色质状态的差异。
CUT&Tag技术正在快速推动表观遗传学研究的前沿发展，百泰派克生物科技为您提供专业的CUT&Tag技术一站式服务，助您精准解析染色质状态，揭示基因调控的奥秘，为疾病机制研究和药物开发提供强有力的支持。我们的服务涵盖从样本准备、抗体优化到高通量测序及数据分析的全流程支持，确保为您提供高质量的染色质修饰和转录因子结合位点分析数据。与百泰派克合作，让您的研究迈向新的高度！
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