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俗话说：常在江湖漂，哪能不挨刀，这句话放在我们二代测序行业也是一样适用滴。测序测多了，总会碰到这么几个样本测序下来发现测序质量不是这么合格的，各位都知道reads的测序质量这玩意儿可是数据分析的第一道关卡，如果连测序质量这道关都不过了的话，就更别谈后面的数据分析了（那都是浮云~）。那么问题来了，当一个多达好几G的大块头文件放在我们面前的时候，我们该如何对这个大块头进行质量控制的分析呢？莫慌，作为程序猿的我今天决定把珍藏了多年的测序质量控制神器--fastqc和大家进行分享（嘘，一般人我不告诉的，因为都是血泪史啊，有血，有泪，有。。。）。

Fastqc软件是一款针对第二代测序 (NGS)产生的数据进行质量控制分析的软件。此软件基于java分析程序，支持输入fastq, bam, sam等格式的数据文件。它的分析内容包括了如下内容：

1. 测序数据的基本信息

2. 每个碱基的质量值

3. 每条reads序列的质量值

4. 每条序列的ACGT组成

5. 每条序列N的含量

6. 序列中duplication程序

7. K-mer信息

大家可以在服务器上简单地输入如下指令就可以运行此软件，指令如下，拿走不谢：

fastqc –q read_R1.fastq.gz –o outputDir

哈，指令就是这么简单。接下来我们来看看运算完成后的结果。首先我们来看下大家都熟悉的碱基质量分布图：

相信大家都对这张图再熟悉不过了，程序猿的我也是天天看，真的都已经看到吐了，然后吐着吐着就习惯了。这张图里的quality就是传说中的Fred值，计算公式为-10*log10(p)，其中p为测错的概率，我们通常说的Q20数据就是根据这个数值来算的，即如果一条reads某位置出错概率为0.01时，那么它的quality就是20。So easy! 图中横轴代表每个测序碱基的位置，纵轴代表此位置上碱基的各种姿势的quality。红色的横线表示中位数，黄色矩形是25%-75%测序质量区间，而黄色矩形上面和下面的“丁”字型的小尾巴是什么？那个是10%-90%测序质量区间，而蓝线是平均数。上图中所有的黄色矩形都在30以上而且小尾巴基本上都没有，嗯，完美。

上面这张图厉害了，叫“碱基含量分布图”，它根据碱基的位置对每个位置上的A,C,G,T的含量进行统计，你们可能会问怎么就厉害了？根据我多年来吐到习惯的丰富经验来看，可以很负责任地告诉大家，如果是一个比较完美的分布图，应该是所有位点上的每条线应该平等且接近的。如果当部分位置上的碱基比例出现bias时，即四条线在某些位置纷乱交织，往往提示我们可能存在overrepresentedsequence的污染。很多人可能会更关注第一图而忽略了这张图。

说完碱基含量分布图，怎么能少了GC含量分布图呢？上面所示图中红色曲线是实际的测序GC含量分布图，而蓝色曲线则是理论分布（正态分布，不过均值不一定都是50%，而是由平均GC含量推断的）。如果红色曲线形状存放比较大的偏差（俗称“跑偏”）的话，往往是由于文库的污染造成的。记住，红色曲线越平滑越好，越接近蓝色曲线越好。

最后还有一张就是这张duplication图了，此图中X轴为reads重复的次数，y轴为重复次数对应的reads占uniquereads的比例。如果序列中有重复，那么表明存在富集的偏好（enrichment bias）（比如：测序过程中的PCR重复，转录组测序中某些基因表达量高），序列重复比例越高，则表明实际有用的序列越少。上述这张图目测还不错，右边尾巴处只有一点点的重复。嗯，已经非常不错了，不过还是有一点点小遗憾（忘了和大家说了，本猿是处女座）。

好了，我所知道的都倾囊相授了，脑子也已经显然不够用了。天色已晚，今天就先说到这里了，大家都看明白了吗？那还不赶快去看看那些咱们测过的测序质量去？

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