果实成熟是一个有序而复杂的过程，了解果实成熟机制，不仅可以了解如何保持果实品质，而且可以指导延长贮藏期的方式，已有研究表明多种翻译后修饰和动态转录重编程均参与果实成熟调控，但翻译后修饰和转录调控在果实成熟过程中的相互关系尚不清楚。 2021年11月，华南农业大学陆旺金教授和陈建业教授课题组在植物学Top期刊Plant Physiology（IF 8.34）发表了题为“Phosphorylation of transcription factor bZIP21 by MAP kinase MPK6-3 enhances banana fruit ripening”的研究论文。文章利用磷酸化蛋白质组学发现了转录因子MabZIP21在果实成熟过程中的重要作用，揭示了MabZIP21影响香蕉果实成熟的具体分子机制。中科新生命提供了磷酸化修饰蛋白组学技术支持服务。 研究材料 未成熟香蕉、成熟香蕉（自然成熟、乙烯催熟、1-MCP延缓成熟）
技术路线
步骤1：磷酸化修饰蛋白组学结果分析；
步骤2：MabZIP21下游靶向基因筛选；
步骤3：MabZIP21相互作用蛋白的确定及功能验证；
步骤4：MabZIP21主要磷酸化修饰位点的确定及其功能验证；
步骤5：MabZIP21的反馈调节。
研究结果
1. 磷酸化蛋白质组学分析揭示MabZIP21磷酸化参与香蕉果实的成熟
作者使用未成熟和成熟的香蕉（乙烯诱导成熟）组织样本进行磷酸化蛋白组学分析，共鉴定到63条在果实成熟过程中差异化表达的磷酸化肽段（对应49个蛋白）（图1），其中转录因子MabZIP21 (Ma04_p35070)的磷酸化水平变化最大。实验证实，MabZIP21在自然成熟、乙烯催熟和1-MCP延缓成熟三种果肉中的转录本水平均显著增加，并在成熟阶段达到最高水平（图2A）,其磷酸化水平在成熟果实中远高于未成熟果实（图2D和2E）。
图1 成熟果实中的磷酸化蛋白组学分析
图2 成熟果实中MabZIP21转录本和磷酸化水平的变化
2. MabZIP21参与调控多种成熟相关基因
为了深入了解MabZIP21控制香蕉成熟的机制，作者利用DAP-Seq等技术寻找MabZIP21的下游结合基因（图3），结果发现MabZIP21可直接结合多种成熟相关的基因（比如MaACO1,MaPG3,MaPL5,MaPL15,MaPE42,MaPE51,MaEXPA15）并激活它们的转录，证明了MabZIP21参与香蕉的成熟过程（图4）。
图3 MabZIP21靶向基因的筛选
图4 MabZIP21与香蕉成熟相关基因的启动子直接结合
3. MabZIP21相互作用蛋白的确定及其功能验证
磷酸化组学结果发现MabZIP21的磷酸化水平发生了明显的改变且MAPK激酶（相较于其他激酶）更多的参与了成熟香蕉组织中磷酸化水平的变化（图1D），后续验证实验发现MaMPK6-3（MAPK激酶的一种）可直接与MabZIP21结合（图5A、5B和5D），并增强了MabZIP21的转录激活能力（5E）。另外研究还发现MabZIP21在基因调控中可以形成同源二聚体（图5B和5D）。
将MaMPK6-3瞬转至香蕉中，结果发现MaMPK6-3过表达的香蕉成熟的更快（图6B和6C），且磷酸化蛋白的含量更高（图6D和6E），证明了MaMPK6-3在香蕉成熟和蛋白质磷酸化过程中发挥了重要作用。
图5 MabZIP21与自身及MaMPK6-3相结合
图6 MaMPK6-3的过表达促进香蕉成熟、提高磷酸化蛋白含量
4. MabZIP21被MaMPK6-3磷酸化的主要位点确定及其功能验证
为确定MabZIP21的磷酸化修饰位点，作者采用Phos-tag SDS-PAGE结合LC-MS/MS的方式进行分析，结果表明Ser436和Thr318是MabZIP21上的磷酸化位点（图7A和7B）。点突变实验证实Ser436和Thr318的突变会影响MaMPK6-3对MabZIP21的磷酸化修饰（图7C和7D）、MabZIP21与MaMPK6-3的结合（图7E和7F）、MabZIP21的转录激活活性（图8A）、MabZIP21与下游成熟相关基因的结合能力（图8B-8D），以及影响果实的成熟速度（图9C-9E）和MabZIP21下游成熟相关基因的表达水平（图9F）。
图7 MabZIP21磷酸化位点的鉴定
图8 Ser436和Thr318磷酸化对MabZIP21活性的影响
图9 Ser436和Thr318磷酸化对香蕉果实成熟的影响
5. MabZIP21激活MaMPK6-3及其自身的转录
转录因子通常通过形成反馈调节来调控自身的转录。本研究证实MabZIP21可与MabZIP21和MaMPK6-3的启动子结合并正向调控他们的表达(图10)。
图10 MabZIP21调控MaMPK6-3及其自身的转录
小结
磷酸化蛋白组学技术助力揭示磷酸化修饰的MabZIP21在采后香蕉果实成熟衰老过程中的新机制，该研究成果为改善果蔬贮运品质和制定合理的保鲜物流措施提供了理论支撑。
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