总的说来，荧光检测技术可大致分为两大类：通用型的荧光染料检测法和高特异性的荧光探针法。前者主要是利用荧光染料(如SYBR Green I)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，优点是：无需另外设计荧光探针，无需特别优化条件，简便易行，成本较低，能适用于任何一款定量PCR仪，缺点是专一性不如探针法；而后者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模版，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测(见下表)，不过增加了荧光探针的成本。

   除了以上这些，还有双探针系统(bi-probe system)、BODIPY FL标记探针、Light- up探针、iFRET(induced fluorescence resonance energy transfer) 技术、Qzyme 探针和Magiprobe等等。

这么多种荧光标记方法，在选择的时候当然要根据各人实验设备、实验目的以及实验要求，还有经费来判断了。

荧光染料

   对于专一性要求不高的实验，或者是大规模高通量的实验，使用方便、花费较小的荧光染料可以作为你初步的选择对象。老实说，荧光染料法实质上无非就是常规的PCR反应中添加了荧光染料，借助染料和双链DNA的结合所发出的荧光实时监控反应的进程。由于不需要设计序列特异性探针和优化反应条件，价格低廉，通用性强，而且荧光染料法可用于任何一种型号的定量PCR仪，因而同样得到广泛采用。荧光染料法的专一性和PCR没有本质的区别---但是作为“失之毫厘，谬之千里”高度精确的实验，你依然可以选择更好的荧光染料、更严谨专一的PCR酶、更好的缓冲体系来提高反应的可靠程度。

   在荧光染料法的定量PCR反应试剂中，最常用的是SYBR Green I，这种高灵敏度，较低毒性的核酸染料最大激发波长497nm，最大发射波长是520nm，在结合双链DNA分子后荧光增强800-1000倍，灵敏度较EB更高，毒性较EB低，可避免EB对于小分子量DNA灵敏度较低，而在监测大分子量DNA区域可能会出现背景色等等弱点，因此经过时间的筛选渐渐成为了定量PCR荧光染料的“当家花旦”。

在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA双链后荧光信号显著增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物，SYBR Green染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

   荧光染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，定量PCR仪连续监测每个样品的荧光值。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的产物，因此用溶解曲线数据就可以进行定量监督了。

SYBR的主要优势：

   安全性：SYBR染料的致突变性远低于EB数倍甚至数十倍(取决于不同受检物种或株系)

超高灵敏度：具有1000倍以上的荧光增强效果和0.6的量子产量；与此相比，EB只有大约30倍的荧光增强效果和0.15的量子产量。因此，SYBR Gold检测核酸的灵敏度是EB的十倍以上。(这主要是因为SYBRGreen是和DNA小沟结合，而EB则是嵌入到碱基之间)

使用电泳后染色程序可提高灵敏度，而渗透入凝胶的速度极快。

通用性：可在各种类型的凝胶如高浓度琼脂糖、乙二醛琼脂糖、甲酰胺琼脂糖、聚丙烯酰胺和尿素-聚丙烯酰胺凝胶中检测双链DNA。

   简便易用：只须将凝胶在染色液中保温10-40分钟(取决于凝胶的厚度和浓度)，无须脱色，背景极低。

   与其他分子生物学技术兼容：对酶切、连接和PCR反应都没有影响。