细胞转染注意事项,你都get了吗？(下)

细胞转染实验从开始设计到最终的效果检测，可以由6个过程组成：核酸准备、试剂选择、细胞铺板、转染操作、细胞培养、效果检测。每一步都会影响最终的结果，均存在不同的注意事项。上个月小翌分享了前3个过程的注意事项：

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本期分享后面3个过程的注意事项：

转染操作

1.条件摸索与优化：

不同的细胞及转染试剂要求转染的条件是不同的，同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状也会发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。在进行不同核酸或不同细胞系的转染时，需要再次优化实验条件。不同的培养体系、不同的核酸与试剂比例，最好是在第一次实验前做一个预实验。初学者通常都不会在乎加入的核酸量，甚至愿意多加点，但是要注意的是，核酸量过少固然转染效率不高，但过多同样会降低转染效率。

2.无血清配置复合物：

通常在开始准备核酸和转染试剂稀释液时要使用无血清的培养基或试剂自带的组分，因为血清会影响复合物的形成。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附，影响转染效率。现在市面上也有一些改进了的转染试剂，可以在转染时含有血清。所以根据具体的试剂，操作上会有差异。

3.孵育时间：

不同的转染试剂在核酸-转染试剂复合物形成中，需要时间不同，一般是5min-30min之间，要注意避免孵育时间过长。

4.抗生素影响：

在部分转染试剂的使用中，要考虑抗生素的影响。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞，降低细胞的活性，导致转染效率降低。

细胞培养

1.优良的培养试剂：

血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。胎牛血清（FBS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。血清质量的变化直接影响细胞生长，因此也会影响转染效率。对于RNA转染，如何消除血清中潜在的RNase污染也是值得关注的环节。

2.是否换液：

转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入，补充营养。加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。可实时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。尽管有些转染试剂号称不需要换液，也能取得不错的效果，但是为了使细胞培养的环境更好，建议在转染后6小时左右换有血清的培养基可能会更好。

效果检测

1.检测方法的选择：

对于转染效果的验证主要取决于实验目的基因/蛋白的性质。主要是mRNA和蛋白水平的验证。mRNA水平可以使用普通PCR 或者定量PCR，前者是定性，后者定量。但是最主要的还是蛋白水平的检测，如果是膜蛋白，那么流式检测最方便；如果是胞外分泌型，那么用上清液做ELISA或者Western都可以；如果是胞浆分泌型的那么就用Western或者流式都可以。

2.检测时间的选择：

一般在转染24-72h，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测实验。转染48~72h后可检测蛋白表达，如用于重组蛋白、抗体生产等。

以siRNA为例，siRNA转染后，在mRNA水平下降后，接下来才会有蛋白水平的下降，一般来说，转染后48-72小时进行蛋白检测通常会得到较好的结果。

3.稳转筛选：

如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的抗生素就行筛选，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

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IF55分！翌圣转染试剂助力高分文章

翌圣明星CP--转染试剂与PCR产品又登《Cell》期刊

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