普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤---原位PCR

原位PCR

1 概述

自20世纪80年代中期PCR技术诞生以来, 研究人员就一直探索着将PCR技术与形态学研究结合起来。1990年, A.T. Haase等首创了原位PCR(In situ PCR, ISPCR), 当时称为 “细胞内PCR”。原位PCR是原位杂交和PCR结合的产物, 兼有二者的优点, 具有较好的灵敏性与专一性, 可同时获得组织、细胞及染色体的形态结构信息与分子信息, 又能检测出细胞中单拷贝或低拷贝的DNA、RNA序列。

2 原位PCR原理

原位PCR是通过在单细胞或组织切片上对特异DNA(或cDNA)进行PCR扩增, 然后采用原位杂交或免疫组织化学反应、荧光检测等技术进行细胞内特定核酸序列的检出及定位的分子技术。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，当进行PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可进入细胞内或细胞核内，以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，从而被保留在原位。这样原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数极扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。

3 原位PCR类型

3.1  直接原位PCR 

直接原位PCR是使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应, 这种标记分子随后进入扩增产物中, 扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交(图1) 。

优点：

（1）操作简便；

（2）流程短；

（3）省时。

缺点：

（1）易发生引物错配或非特异性退火, 容易出现假阳性;

（2）标记的引物会降低PCR效率。

3.2  间接原位PCR

间接原位PCR是在没有标记物的情况下进行PCR反应, 扩增反应结束后, 再用原位杂交技术来检测扩增的信号(图1)。

优点：可以克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题, 成为目前最广泛使用的方案。

缺点：需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程, 所需时间相对较长。

图1  直接原位PCR和间接原位PCR

3.3 原位反转录PCR

在原位 PCR 中加上一步反转录过程(RT) , 新形成的cDNA作为模板用于扩增, 这个过程叫做原位反转录PCR( in situ reverse transcription PCR, 简称原位RTPCR)。它又分为直接原位RTPCR和间接原位RTPCR两种(图2)。

原位RT PCR可用来检测细胞或组织中低拷贝的mRNA或特异基因的表达。

Tips：在原位 RTPCR 中, 首先要对组织样品进DNA 酶处理, 以破坏组织细胞中的DNA。

图2  原位反转录PCR

3.4  PCR原位再生式序列复制反应

Zebe等1994年率先提出了原位再生式复制反应( Selfsustained sequence replication reaction, 简称3SR反应)。它可作为原位RTPCR的一种选择方法用于完整的细胞和组织切片中低拷贝数mRNA的检测。

优点：有利于与免疫组织化学相结合。

4 植物原位 PCR 技术的操作步骤 

植物原位 PCR 的基本步骤包括标本制备、预处理、原位扩增、后处理和检测等。

4.1 标本制备

固定剂的选择和固定的时间、温度因材料标本不同而各异。但固定条件的确定, 必须同时满足 2 个条件:

①保持染色体、细胞和组织标本形态结构的完整性;

②将原位程序中扩增效率的损失减到最小。

Tips：

①对于DNA的原位 PCR, 交联型固定剂(福尔马林、4%多聚甲醛、中性甲醛)较为适宜。交联型固定剂较利于蛋白质和核酸互相交联, 使扩增产物保留在原位,防止其向细胞外扩散或被洗脱。

②固定时的温度也会对结果产生影响, 室温或 37℃固定24～48 h, 可获最强信号。

③标本的年龄对实验结果影响也很大, 最好采用新鲜制备的不超过1个月的染色体标本。用新鲜固定的细胞做原位 PCR, 要比存档的石蜡切片做原位 PCR 敏感得多。

4.2 预处理

预处理可增加细胞的通透性, 促使反应试剂进入细胞内, 并使待扩增的靶序列暴露。在进行消化处理时, 酶种类的选择、浓度、温度和处理时间等条件的优化对于原位PCR都很重要。

Tips：

①胃蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶K均可用于消化。推荐使用胃蛋白酶或胰蛋白酶, 因为蛋白酶K较难失活且易引起过度消化, 而胃蛋白酶、胰蛋白酶在以后的洗涤步骤中, 可通过提高pH抑制其活性, 或通过加热使其失活。

②酶处理的方法取决于固定剂和标本类型。多聚甲醛和戊二醛固定的材料比FAA固定的材料需更长的酶处理时间, 且具小液泡的