结直肠癌（CRC）是第三大最常见的癌症，全球癌症死亡率第二。晚期CRC转移患者的预后较差，耐药性严重。因此，寻找与CRC发病机制相关的新基因对开发有效的CRC治疗方法至关重要。越来越多的研究表明，脂质代谢异常是CRC等癌症的标志性特征，然而，参与CRC脂质代谢依赖的分子机制仍知之甚少。角鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase, SQLE)是胆固醇生物合成中的限速酶，有研究表明SQLE在CRC中过表达，但SQLE在CRC进展中的潜在作用仍存在争议。香港中文大学的于君研究团队通过对配对的CRC和癌旁组织样本采用mRNA和蛋白表达分析，SQLE转基因（Sqle tg）小鼠粪便样本进行宏基因组学和代谢组学分析共同揭示了SQLE在CRC中的作用，相关研究成果发表于《Gut》。
1. SQLE在CRC中过表达且与CRC预后不良相关
对三个独立的CRC队列（香港队列、TCGA 和 GDS4382）中SQLE的mRNA和蛋白表达进行分析，发现在原发性CRC组织中SQLE的 mRNA和蛋白的表达均高于对照癌旁组织。使用Kaplan-Meier曲线和多变量Cox比例风险回归分析评估SQLE对CRC患者预后的影响，结果显示SQLE mRNA的高表达与CRC患者差的预后相关，是CRC疾病特异性预后不良的独立因素。进一步借助免疫组化对207例CRC患者进行TMA分析也证实了SQLE能在蛋白水平上预测患者的预后（图1）。可见SQLE mRNA和蛋白表达是预测CRC患者生存不良的独立预后因素。
图1. SQLE在CRC中表达上调预示着较差的生存
2. SQLE过表达促进CRC发生
在体外细胞水平上证实了SQLE通过抑制细胞凋亡和激活细胞周期进程来促进CRC细胞生长后，进一步在体内动物水平上以Rosa26-Sqle tg小鼠与Cdx2-CreERT2小鼠杂交构建结肠特异性Sqle tg小鼠来探究SQLE在体内CRC发生中的相关性。与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠的肿瘤发生率、肿瘤数量和肿瘤负荷均显著增加，Sqle tg结肠内CRC形成，伴有结肠异型增生和高度异型增生的小鼠比例增加。同时Sqle tg小鼠在CRC中的致癌功能可以通过细胞增殖增加的Ki-67评分和细胞凋亡减少的TUNEL评分来证明。通过对小鼠的结肠组织进行癌症通路PCR分析，观察到细胞增殖标志物Mki67、Ccnd2和E2f4表达上调，而促凋亡基因Casp9和Casp2表达下调，从而证明Sqle在CRC肿瘤发生中促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。在CRISPR/Cas9的全身Sqle KO小鼠上构建AOM-DSS化学致癌模型，与野生型相比，Sqle KO小鼠结肠肿瘤数量减少，再次证明Sqle在体内结直肠肿瘤发生中的致癌功能（图2）。
图2. 结肠特异性Sqle tg小鼠促进结直肠肿瘤发生
3. SQLE促进胆固醇从头生物合成
SQLE是胆固醇生物合成的第二限速酶，在LOVO和SW1116细胞中，SQLE过表达增加了胆固醇生物合成基因（HMGCS1、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、FDPS和FDFT1）的mRNA表达，蛋白印迹分析发现过表达SQLE的细胞或Sqle tg小鼠的 HMGCR、FDFT1和FDPS 蛋白水平升高，而 SQLE敲低或Sqle+/−小鼠相应基因的蛋白水平下调，提示SQLE能促进胆固醇从头生物合成，进而促进CRC细胞增殖（图3，图4）。
图3. SQLE过表达促进胆固醇生物合成基因表达
图4. SQLE敲低抑制胆固醇合成途径基因表达
4．Sqle tg小鼠肠道菌群失调及代谢组改变
肠道菌群失调是CRC发生的新致病因素，作者对Sqle tg和野生型小鼠粪便进行鸟枪宏基因组分析，Sqle tg小鼠的α多样性指数呈下降趋势，并测定Sqle tg和野生型小鼠的细菌组成变化，观察到Sqle tg小鼠中Desulfovibrio fairfieldensis, Rhodococcus erythropolis, Brucella abortus和Chlamydia muridarum等致病菌显著富集，而保护性细菌如Streptomyces violaceusniger和Pseudomonas sp Leaf58减少，经qPCR验证这些关键菌种类的变化，表明体内SQLE过表达促进肠道菌群失调。
已知富集的致病菌具有多种代谢活性，对小鼠粪便进行非靶向代谢组学分析，结果与野生型小鼠相比，Sqle tg小鼠粪便富含次级胆汁酸如石胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、去氧胆酸，并经靶向代谢组学证实Sqle tg小鼠次级胆汁酸如石胆酸、异石胆酸、异别石胆酸和去氧胆酸的升高。次级胆汁酸是在肠道菌群的作用下由初级胆汁酸转化生成的，对Sqle tg小鼠肠道菌群和代谢物进行相关性分析，发现次级胆汁酸和致病菌C. muridarum显著相关，提示C. muridarum可能参与促进次级胆汁酸的增加。此外，发现四种病原菌均与代谢物改变呈正相关，表明Sqle tg表达在小鼠CRC进展中调节肠道微生物组和代谢物（图5）。
图5. 结肠特异性Sqle tg小鼠肠道菌群和代谢物改变
5．SQLE过表达损害肠道屏障功能
次级胆汁酸作为一种内毒素，其水平升高是CRC的重要风险因素，它对结肠上皮细胞有毒性，破坏肠道屏障功能，而肠道菌群失调也与肠道屏障受损密切相关，因此，SQLE过表达诱导的肠道菌群失调可能会导致肠屏障功能障碍。通过对Sqle tg和野生型小鼠肠道屏障功能进行FITC-葡聚糖跨上皮通透性分析，发现Sqle tg小鼠血清FITC-葡聚糖水平更高，电子显微镜（EM）也观察到Sqle tg小鼠紧密连接的破坏。上皮紧密连接是由细胞连接蛋白维持的，蛋白质印迹分析发现Sqle tg小鼠结肠中的细胞连接蛋白Jam-c和occludin下调。此外，Sqle tg小鼠内粘液关键成分MUC2的mRNA水平也下调。肠漏诱导促炎反应，Sqle tg小鼠结肠组织炎症通路的PCR阵列分析显示CxCl3、CRP和CXCR2等促炎因子显著上调。综上，肠道菌群失调-代谢物轴可能导致 Sqle tg小鼠肠道屏障功能障碍。
进一步收集AOM模型的Sqle tg和野生型小鼠的粪便移植到无菌(GF)小鼠体内，以探究Sqle tg表达诱导的肠道菌群失调是否能影响结肠细胞增殖。在处死小鼠前进行FITC葡聚糖跨上皮通透性分析，发现Sqle tg小鼠粪便进行灌胃的GF小鼠血清中FITC-葡聚糖水平高于野生型小鼠粪便灌胃的GF小鼠，并经EM 证实肠道屏障破坏。同理与移植野生型粪便相比，移植Sqle tg小鼠粪便的GF小鼠细胞连接蛋白Jam-c和occludin表达下调，同时Ki-67染色表明其显著促进结肠上皮细胞增殖。总之，SQLE诱导的肠道菌群失调使肠道屏障功能受损进而促进结肠细胞生长（图6）。
图6. 肠道菌群-代谢物轴介导Sqle tg FMT小鼠肠屏障功能障碍
6. 药物抑制SQLE提高CRC的化疗效果
使用SQLE抑制剂特比奈芬处理HT29和DLD1细胞，发现特比奈芬在体外剂量依赖性抑制HT29和DLD1细胞生长。此外，特比奈芬也显著抑制原发性CRC类器官的生长。接着评估CRC常用化疗药特比奈芬与奥沙利铂或5-FU联合用药效果，发现特比奈芬使HT29和DLD1细胞对奥沙利铂和5-FU的生长抑制更敏感，联合指数(CI)定量评估表明特比奈芬与奥沙利铂或5-FU的联合用药具有协同作用，在体外协同诱导细胞凋亡。进一步建立裸鼠皮下移植瘤模型，将1106个HT29细胞植入裸鼠背侧，分为六组：（1）载体；(2)特比萘芬；(3) 5-FU；(4) 奥沙利铂；(5) 特比萘芬+5-FU 和(6) 特比萘芬+奥沙利铂。结果表明，单药治疗可抑制约50%的肿瘤生长，且与载体相比，特比奈芬+5-FU和特比奈芬+奥沙利铂用药均可使肿瘤完全停止生长，效果明显优于单药治疗。在CRC治疗中SQLE可作为治疗靶点，抑制SQLE可以提高CRC化疗效果。
图7. SQLE是CRC的治疗靶点
小结
本研究通过细胞系、结肠特异性Sqle tg小鼠和Sqle KO小鼠模型建立了SQLE作为CRC的致瘤因子，明确了SQLE在CRC中的致癌作用，SQLE可以促进CRC细胞增殖和存活，并通过引起肠道菌群失调、代谢物改变、肠屏障功能障碍进而影响肠道肿瘤微环境。特比萘芬对SQLE的阻断作用对CRC细胞具有生长抑制作用，因此特比奈芬联合5-FU或奥沙利铂可以显著提高治疗效果，提示其在CRC治疗中的临床应用潜力。
参考文献
Squalene epoxidase drives cancer cell proliferation and promotes gut dysbiosis to accelerate colorectal carcinogenesis. Gut. 2022.
原文阅读，请扫描下方二维码
提取码：jtbx
绘谱帮你侧
糖尿病、肝病、胃癌、IBD、结直肠癌等临床疾病中胆汁酸种类和含量的改变可影响宿主菌群分布、肠道屏障功能、信号传递等生物过程，从而在一定程度上调节胆固醇代谢稳态、葡萄糖代谢稳态、胰岛素敏感性等临床表型。麦特绘谱采用LC-MS/MS技术平台通过多种同位素标记胆汁酸为内标精确定量60+种胆汁酸，目前可提供胆汁酸全谱（60+种）及简谱（人24种/鼠23种）分析，可满足不同检测需求。此外，麦特绘谱拥有业内强大的Q600全定量代谢组、Q300全定量代谢组、Q200宏代谢组、代谢流等方法，详情欢迎咨询麦特绘谱热线400-867-2686。
往期推荐 >>>
1. Protein & Cell︱结直肠癌（CRC）和肝细胞癌（HCC）的肠道菌群差异
2. 客户案例 | Microbiome：代谢物与菌群的相互作用或是结直肠癌潜在诊断标志物
4. 客户成果 | 蔡国响团队发表多项结直肠癌侵袭转移相关研究成果
5. International Journal of Cancer | 前瞻性研究：与结直肠癌风险相关的血液代谢物
