涨知识 | qPCR专场一：如何做好扩增片段和引物设计？

荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种检测方法。该方法通过在PCR体系中添加荧光基团来记录DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的，并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章，走上人生巅峰呢？

对于荧光定量PCR数据的准确性而言，反应效率至关重要。在理想状态下，PCR反应中对应的靶标在每个循环中进行复制，每个循环增加一倍的分子量，对应的即为100%的扩增效率。随着循环数的增加，效率的变化或差异会被放大，因此，任何造成与100%效率的偏差都可能导致数据不准确。

扩增片段设计技巧

不少小伙伴在进行引物设计时，对于目的扩增片段的要求没有太多关注。然而目的片段对于做好荧光定量也十分重要。选择较短且特异性高的目标片段是一种减少效率偏差的方法。

在给定的时间周期内扩增100个pb的靶标片段比扩增1000bp的靶标片段更能保证完全100%合成。因此，在荧光定量PCR实验中80-200个bp能保证结果更加精准。另外较短的靶标片段受模板完整性变化的影响也相对较少,例如核酸样本(RNA或cDNA)轻微降解且靶标片段较长，则上游引物和下游引物很难在同一DNA片段中找到其互补序列。

靶标序列的特异性是效率偏差的另一个重要因素，靶标序列的特异性选择可帮助引物的结合位点在基因组中是唯一的，从而降低引物在样品基因组中其他区域扩增类似序列的可能性。

引物设计技巧

引物设计的好坏，密切关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否。所以正确设计出引物是qPCR成功的重要一步。

qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则，见下表。

*1 OLIGO Primer Analysis Software

*2 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

其中qPCR引物设计需要着重关注以下几点：

减少引物二聚体的发生

非特异性产物本身会和SYBR 染料结合导致荧光产生，从而人为地改变反应的Ct值。非特异性扩增可以通过竞争反应组分来影响反应效率，从而导致数据准确性降低。引物二聚体是一类常见的非特异性扩增产物。引物二聚体通常是由正向和反向引物之间的相互作用引起的，但也可能是正向-正向或反向-反向引物退火的结果，或者单个引物自行折叠的结果。如果二聚化以交错的方式发生作用，则可能发生一些片段延伸，导致产物接近预期靶标片段的大小，产生假阳性结果。

区分isoform

对于同一个基因名来说，可能会有不同的isoform。isoform指的是，对于同一个基因，它的mRNA有多种不同剪接方式，这个时候表达出来的的蛋白可能会有不同，所以小伙伴们在设计实验的时候，一定要想清楚自己要做的是哪一个isoform。

举个“栗子”：比如说一个基因有四种不同的isoform，如果大家想要检测的是四种不同剪接方式转录本之和，那么设计引物时就要针对这四个isoform的共有序列设计。如果只想检测其中一种isoform，那就要在这个isoform与其他三个isoform的不同序列位置设计引物。

跨内含子设计引物

跨越内含子设计引物可以区分并且规避基因组DNA (gDNA)污染。gDNA可能与目的转录本共扩增，产生无效的数据。在荧光定量PCR实验中避免gDNA干扰的最佳方式是严谨的引物设计。

引物设计的序列最好选择相邻的外显子或一端或两端引物跨越内含子设计。当上游和下游引物在同一外显子内发生退火时，其可扩增DNA和RNA上对应的序列。当引物在相邻外显子中退火时，只有cDNA会被扩增，因为此时源自gDNA的扩增片段会包括内含子序列，导致扩增子太长，无法在荧光定量PCR的反应条件下有效扩增。

以人基因组来说，平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子，80%的外显子长度小于200bp，少于10%的内含子长度在1100bp以上，不到0.01%的内含子长度小于20bp。例如外显子长度200bp，为了兼顾扩增子长度，我们可以把上游引物设置在外显子1和外显子2的中间，下游引物设置在外显子2的位置。

以上是引物设计需要注意的问题，在初步设计好引物之后，我们需要在NCBI上进行BLAST检验，来确保产物的特异性。

理论知识很丰富了，现在让我们实战一下吧！

第一步

选择靶基因

打开NCBI，选择“Gene”，输入想要检测的基因名称，我们以人基因“ALAD”为例。

会出现很多搜索结果，我们选择需要的种属来源，即“human”，如果你知道Gene ID（每个基因有且只有一个特定的ID，类似于人的身份证），也可以根据Gene ID来选择。这里我们选择搜索结果中的第一个。

点开之后，会出现很长的页面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”栏下的NM编号，不同的NM编号，代表不同的isoform。选择想要检测的那一个。

确定NM号点击后，可以看到这个isoform的一些基本信息。

例如：gene代表基因长度3129bp，CDS代表编码蛋白区域149-1141bp

以及此基因的序列，如下图所示。此序列就是设计引物时对应的模板。

第二步

用软件设计引物

引物设计软件有很多，例如oligo7、Primer5、Clone Manager等，以及很多在线网站，例如Primerbank （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/）、Primer3plus（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）、NCBI 的Primer BLAST等。在手头没有安装合适的软件的时候，我们可以选择在线网站设计引物。

这里以延续第一步使用NCBI确定靶基因的步骤为例。了解完我们所需的isoform后，我们可以点击右侧的“Pick Primers”，就能直接进入Primer-BLAST的页面进行引物设计了。