超详细图文版：如何实现m6A测序数据可视化？-自主发布-资讯-生物在线

m6A或其他修饰MeRIP测序之后经常会需要通过一种“可视化”方法，直观考察以及展示到文章中个别基因或区域的测序原始信号（coverage）和序列比对情况，即展示甲基化峰。类似的可视化展示也常常应用在一些其他的需要分析信号峰的测序中，如MeDIP-seq、ChIP-seq、ATAC-seq等。今天为大家逐步详细介绍用IGV软件进行甲基化峰可视化的操作方法，其中也囊括了一些常见问题的解答。

FAQ

Q1: 测序结果中的位点位置在可视化中全部看不到峰？——注意基因组版本选择正确（见3.加载基因组）

Q2: 测序结果中差异位点在IGV中趋势相反、不明显？——注意纵轴scale调整统一（见6.调整图像）

Q3: 样品导入不进去？——注意bam文件与bai文件同名、zoom in 放大看结果（见5.导入样品比对文件）

Q4: 加载基因组报错？——（见3.加载基因组）

Q5: 如何看甲基化峰位在转录本什么区域？文献中peak下方基因转录本示意图是怎么做的？IGV中最下方蓝色转录本，矩形线形箭头都代表了什么，怎么看？——（见4.加载注释文件）

Q6: 如何将样品IP和Input重叠起来看？——（见6.调整图像）

OUTLINE

1.获取IGV软件
2.运行软件
3.加载基因组
4.加载注释文件
5.导入样品比对文件
6.调整图像
7.导出图像

1、获取IGV软件

方式一：
云序生物测序报告中：Report>Sequence_Results>Alignment>IGV software中已经提供了IGV_2.4.10版本的软件压缩包，解压后打开可直接点击igv（.bat）文件运行，无需安装。
*如果运行报错或操作界面错乱，可能由于java版本不对应，可尝试方式二下载java included IGV。

方式二：
自行从网站下载：
http://software.broadinstitute.org/software/igv/download

建议选java included的版本。

下载的版本需要安装：

打开点击igv（.bat）文件运行。

2、运行软件

点击igv（.bat）文件运行后，等待软件加载。尤其是电脑上第一次运行时等待时间可能会稍长。

加载完毕Loading Genome...框消失，操作界面如下

*如果出现如下报错，原因可能是网络信号不佳，或IGV服务系连接问题。如果确认网络状态正常仍不能解决，可改其他时间尝试，或自行手动导入自己储存在本地的基因组（见下文3.加载基因组）。

3、加载基因组

方式一：
左上角可看到基因组信息，一般软件初始会默认加载的人类基因组Human hg19版本。如果测序数据分析使用的是其他基因组，需要在此选择，此处包含了一些常见基因组版本可直接选择。点击More有更多的基因组版本可供选择。务必与测序分析所使用的版本保持一致。
（云序生物提供的测序服务，使用的基因组版本见报告中:
Report>Sequence_Results>Supplementary>Sample & groups表格中Genome build）

方式二：
如果是特殊物种不在此列的（或网络等原因加载失败的），则需要自行导入基因组：菜单选择Genomes>Load Genome from File...

打开自己预先储存在本地的基因组文件。（.fa文件）
（云序生物提供的特殊物种的测序服务，基因组文件如非客户提供，可通过销售提交申请）

4、加载注释文件

通常加载完基因组，IGV软件会自带该物种Refseq注释信息，在最下方。

选择染色体并且zoom in之后可以看到基因组上各位置的具体基因和转录本。

转录本上线性为内含子区域，蓝色矩形为外显子区域，其中两端的较窄的矩形为UTR区。转录本上箭头方向向右->->->-，则该基因在正链上，左侧的UTR区为5’UTR；转录本上箭头方向向左-<-<-<-，则该基因在负链上，右侧的UTR区为5’UTR。

有箭头间隔不均匀的，说明该基因有多个转录本，在此重叠了。可右键点击左侧track名（RefSeq Genes）选择“Expanded”模式查看多个转录本的情况。

有时分析所用的注释文件与IGV默认加载的注释信息有出入，想要对照自己所用的注释信息来查看，可将自己使用的注释文件（.gtf）拖入红框区域。
（云序生物提供的测序服务，使用的注释文件见：Report>Sequence_Results>Alignment）

*出现建议建立索引文件的提示，可以点Go等待自动生成索引文件后再次拖动gtf文件进来（推荐），但如果gtf文件是没有sorted过的（文件名中没有.sorted.字样）则无法建立索引文件，如果gtf文件是由云序生物提供的，可联系销售。也可以点cancel忽略继续进行（可能加载会较慢）。

5、导入样品比对文件

前面准备工作做完，要考察样品的可视化情况，需要样品比对到基因组后得到的bam文件，并且其对应的索引文件bai文件需要与其存放在同一文件夹中，勿随意改名，如果一定要改，注意bam与其bai文件前面部分名称要一致。进行可视化时可以直接使用bam文件，也可以将其转化为tdf格式文件后使用。

方式一：使用bam文件进行可视化
将bam文件拖入红框区域。

样品刚拖入右侧时，有可能只会显示灰色字“zoom in to see features”。这只是提示需要放大到一定程度才会显示出峰。

界面上方可以选择要观察的染色体、输入染色体上具体位置或者直接输入基因名，也可以点“-”和“+”来放大和缩小区域。Bam文件在缩放区域时可能会较慢需要耐心等待。

Bam文件加载好后，出现两条track，上面一条coverage即通常可视化图中展示的峰形，下面一条track展现的是每一条read在基因组上的比对情况。

作图时可以右键点击track名选择隐藏这条alignment track，以便让出位置展示多个样品中的甲基化峰。

方式二：使用tdf文件进行可视化
由于bam文件较大，读取和调整较慢，可以通过IGV内自带的IGV Tools将bam文件转化为tdf文件来进行可视化。相较bam文件，tdf文件去除了alignment track的信息只保留了coverage信息，但文件变小便于快速操作，并且用tdf文件操作时可以进行多样品叠加展示（见后文6调整图像）。
在菜单选Tools>Run igvtools...

点击Input File后面的browse，选择要转化的bam文件。

选择好以后，Output File会自动命名，不需要再选择。点击Run进行转化。
*有时出现WARNING: BAM index file...bam.bai is older than ...bam，是提示这个索引文件bai文件比bam文件生成的时间要早，而正常情况下理当先有bam再建立它的bai文件，因此软件提醒注意是否文件有误。一般可能只是由于涉及到原始数据二次下载导致文件生成时间改变，可以忽略这个提示。

点击Run之后等待其转换，需要一定时间。此时可以看到Run变灰，并且等待一段时间后在Message信息框可以观察到“..”点逐渐增加，说明正在转换中。完成后会显示“100%”和“Done”。

生成的tdf文件被保存在bam同文件夹中。在igvtools中重新选择其他Input File可逐个进行转换。

*若tdf文件大小为0或特别小，说明转换未完成或不完整，无法使用，尝试重新进行转换。
tdf文件的使用方式同bam一样，直接将文件拖入IGV。

6、调整图像

导入多个样本后，可以右键track名，进行各种调整和操作，将图像调整到满意的形式展示。可以自己多多尝试。下面例举一些常用的操作供参考。
右键样品名可以改样品名（Rename Track）、更改track的高度、颜色、名字字体大小（Change...）等基本操作。

要对比多个样品中甲基化峰时，会需要将各样品纵坐标scale调整至一致才便于直观比较。

可以 1)根据甲基化峰信号值手动调整个别样品的scale：右键点样本名选Set Data Range后输入最大值；

2）单个样品自动调节至合适的scale：右键点样本名选Autoscale，会自动调整到一个可以显露出该视窗内该样本最高信号值的scale；

3）也可以同时选中要统一的所有样品名（按住shift或者control点选）然后右键选择Group Autoscale，则全部样品会被统一采用一个相同的scale。

如果是用tdf文件进行的可视化（见5 方式二），可以将多个样品overlay后用不同的颜色标示，常用在将样品的IP与Input重叠展示。同时选中要重叠的track，右键选择Overlay Tracks。Overlay后注意及时重新命名以免混淆。可以分别Change两个Track的Color （Positive和Negative两条track）.