Strep-tag® / Strep-Tactin®蛋白质表达与纯化系统-其它资料-资讯-生物在线

Strep-tag® / Strep-Tactin®蛋白质表达与纯化系统

作者:盛世中方(北京)生物科技有限公司 2009-01-08T00:00 (访问量:35408)

 

Strep-tag® / Strep-Tactin®蛋白质表达与纯化系统

 

  作为后基因组时代表达克隆和蛋白质纯化技术最重要的供应商之一,德国IBA公司开发了一个称为Strep-tag的通用技术平台。这种快速、合算、多样性地生产和使用重组蛋白的技术平台是IBATU MunichArne Skerra博士教授密切合作开发而成。除了围绕Strep-tag的大型产品组合外,IBA还独家提供应用该技术的蛋白质生产定制服务。

 

  Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途,研究者们发现需要一个肽,该肽与重组蛋白质融合后,能够结合在streptavidin的生物素结合口袋,从而作为纯化tag。最后研究者们成功设计出一个只由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tag II。为了优化结合属性,streptavidin也被设计成为Strep-Tactin。如此,一对优化的结合伙伴被发现了:Strep-tag / Strep-Tactin系统现已成为最被广泛应用的亲和层析系统之一

 

  Strep-Tactin与多种不同的基质偶联,使Strep-tag融合蛋白得以在生理条件下亲和纯化。与其他tag相比,这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性,并仅经一步层析后即可产出超过99%的纯度。

 

 

 

Strep-Tactin: Engineered streptavidin for optimal

binding of a short peptide called Strep-tag

 

  Strep-tag®系统可用于从任何表达系统包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中纯化Strep-tag II蛋白。用于细菌、哺乳动物细胞和酵母的表达载体请参见本栏目相关章节。

 

  除了表达载体,IBA还提供围绕Strep-tag用于蛋白质纯化、检测、分析(蛋白质固定)、蛋白质:蛋白质相互作用研究以及高通量纯化的完整的产品组合。

 

The tag

技术

蛋白质

8个氨基酸

平衡的氨基酸组成 对蛋白质的结构和活性一般没有影响

高选择性和易于控制的结合属性

C-N-末端融合

无需去除

有效和通用的表达载体,标准化的克隆策略

生理条件下的亲和层析

通过颜色改变可见柱再生和活性状态(见下)

可获得超过99%的纯度

Strep-tag适用于:

金属蛋白

膜蛋白

具有多个亚单位的敏感蛋白质复合体

以及其他任何蛋白质

 

 

结合:

GFP Strep-tag 蛋白结合于Strep-Tactin

 

洗脱:

用脱硫生物素

 

再生(颜色控制):

开始去除脱硫生物素

 

再生:

脱硫生物素被完全除去

 

再生:

用平衡缓冲液快速再生

 

 

纯化在E. coli 中过度表达的GFP-Strep-tag II 融合蛋白

图片(从左至右)1GFP-Strep-tag II融合蛋白特异结合在Strep-Tactin SepharoseÒ柱上,而非特异性蛋白质被少量生理性洗涤缓冲液迅速洗去。2、由于加入特异性竞争剂脱硫生物素,Strep-tag蛋白被洗脱。3-5、柱再生:脱硫生物素被黄色溶液HABA取代,后者一旦与Strep-Tactin复合即变为红色。HABA随后被洗涤缓冲液除去,柱子可被重新使用。

 

怎样获得优良无比的纯化因素

  Strep-tag® 纯化系统是基于Strep-tag II肽和特殊设计的Strep-Tactinstreptavidin的变体)之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系统。Strep-tag IIStrep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高将近100。在亲和纯化过程中,附了tag的蛋白质结合在被固定了的Strep-Tactin上。生理缓冲液PBS可与一系列添加剂一起用于该纯化过程。短暂的洗涤步骤之后,在同一缓冲液中加入脱硫生物素(2.5 mM)即可将纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。脱硫生物素是一种便宜的、可逆结合的、稳定的生物素类似物,而生物素是streptavidin的天然配体。这种竞争性洗脱是赋予特异性的第二步,从而得到优良无比的纯化因素。该系统安全、易于使用;纯化柱再生和活性状态可以通过纯化柱上的颜色改变来观察到。

 

  Strep-tag融合蛋白可以经Western blots, ELISA, 电子或荧光显微镜进行方便的检测。有相应的Strep-Tactin酶共轭物和抗Strep-tag II的单克隆抗体供出售。

 

Strep-tag®II对蛋白质的影响可以忽略

  此8个氨基酸的短肽tag由于具有化学平衡的氨基酸组成(WSHPQFEK),因此对重组蛋白的影响可以忽略不计。该tag可以被置于C-端或N-端。建议在蛋白和tag之间加入2个氨基酸的间隔以确保tag的可接近性。总的来说,该tag不干扰蛋白质的折叠或生物活性、不与重金属离子缓冲液杂质反应、无离子交换属性、不会诱导蛋白质聚集。因此无需去除该tag

 

Strep-Tactin®:长效的亲和柱

  Strep-Tactinstreptavidin的一种衍生物,是已知最稳定的蛋白质之一。Streptavidin对以8 M ureaguanidine, 0.5 M NaOH以及50 % formamide (t = 1 h; T = 37 °C)的处理保持稳定。蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶等) 1:50 w/w比例下,37 °C孵育2小时都无法切割 streptavidin。当SDS存在时,仅在温度高于60 °C时,streptavidin才开始降解成单体。经过测试,Strep-Tactin已经被证实具有上述作为长效亲和柱必备的卓越特性,可被重复使用3-5次。而且,Strep-Tactin的中性PI值使非特异性蛋白质或核酸的结合降到最低。

 

Strep-Tactin树脂技术指标

 

  有5种版本Strep-Tactin树脂,区别在于其特性和应用。Strep-Tactin Sepharose®优先用于重力流层析;Strep-Tactin Superflow®Strep-Tactin MacroPrep® 也可用于低压力或FPLCStrep-Tactin POROS® (2050)用于FPLCHPLC层析。每个基质都会表现出不同的非特异性结合性质,当使用某种基质由于非特异性背景而无法获得满意结果时,建议换用其它的基质(亦请见Strep-Tactin Column Evaluation Sets)。此外Superflow尤其适用于增加的流速,也适用于大的蛋白质复合物的纯化。
  请注意,Strep-Tactin树脂被优化用于柱亲和层析,而不适用于批量纯化。批量纯化请使用IBAMagStrep Strep-Tactin包被的磁珠。

1: Strep-tag/Strep-Tactin相互作用兼容的试剂

试剂

浓度

Reduction Agents

DTT

50 mM

β-mercaptoethanol

50 mM

Non-Ionic Detergents

C8E4 Octyltetraoxyethylene

最高0.88 %

C10E5; Decylpentaoxyethylene

0.12 %

C10 E6

0.03 %

C12 E8

0.005 %

C12E9; Dodecyl nonaoxyethylene (Thesit)

0.023 %

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