肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书-软件手册-资讯-生物在线

肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书

作者:上海雅吉生物科技有限公司 2021-05-31T00:00 (访问量:1395)

 

本产品仅供科学研究使用!请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途
肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT-1)试剂盒说明书
规格:100 /96
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
微量法
肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶A 将酰
基转移至L-肉毒碱的反应,在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。
测定原理:
基于肉碱和脂酰辅酶A 在丙二酰辅酶A 存在与否的条件下,通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作
用,产生脂酰肉碱,并释放出巯基辅酶A(COA-SH),与Ellman 试剂DN-TB 反应后,产生黄
色的TNB。通过其吸收峰值得变化(412nm),来定量分析CPT-1 的活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制:
试剂一:液体100mL×1 瓶,
-20℃保存;试
剂二:液体20mL×1
瓶,-20℃保存;
剂三:液体1.5mL×1
支,-20℃保存;
剂四:液体 30mL×1 瓶,4℃保存;试试剂
五:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
称取约0.1g 组织或收集500 万细胞,加入1mL 试剂一和10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或
研钵匀浆。
将匀浆液于600g4℃离心5min
弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心10min
上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的CPT-1(此步可选做)。
在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或
200W,超声3 秒,间隔10 秒,重复30 次),用于线粒体CPT-1 测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1) 在试剂五中加入1mL 无水乙醇,混匀,再加入22mL 试剂四,混匀,37℃(哺乳动物) 或
25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;本产品仅供科学研究使用!请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途
(2) 在试剂六中加入 1mL 蒸馏水,混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育5min; 用
不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3) 在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、220μL 试剂五和10μL 试剂六,混匀,记
412nm 20 秒时的初始吸光度A1 2 20 秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1
CPT-1 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V
×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g
组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1nmol/min/g
鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109W× V ÷V 样总)÷T=177.8×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟催化产生1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。CPT- 1
nmol/min/104 cell=[ΔA×V 反总÷ε×d×109500×V ÷V 样总)÷T=0.3556×ΔA V 反总:
反应体系总体积,2.4×10-4LεTNB 摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cmd:比色皿光径,
1cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2min
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌总数, 500 万。
b. 使用96 孔板测定的计算公式如下:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V
×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义:每 g
组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。
CPT-1nmol/min/g
鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109W×V ÷V 样总)÷T=355.6×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB
定义为一个酶活力单位。
CPT-1nmol/min/104 cell=[ΔA×V 反总÷ε×d×109500×V
÷V 样总)÷T=0.711×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2.4×10-4LεTNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cmd96
孔板光径,0.5cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,0.202 mL
T:反应时间,2 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细胞或细菌
总数,500 万。
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