期刊：EBioMedicine
影响因子: 11.1
主要技术：ScRNA-seq
导语
胆囊癌(GBC)是胆道最常见的恶性肿瘤，诊断晚，生存率低，需要不断寻找新的诊断生物标志物和治疗靶点。人类内源性逆转录病毒(HERVs)在多种癌症中特别容易被重新激活，并与癌症进展和免疫治疗有关。
方法
对4例GBC患者的肿瘤组织及配对癌旁组织进行scRNA-seq。采用双荧光素酶报告试验测定HERV序列增强子活性。
发现
剖析了GBC的细胞多样性并描述了HERV转录组景观。发现HERV以细胞类型特异性的方式转录，不同的HERV家族与不同的生物学效应相关。HERV可能起增强子的作用，可能导致邻近基因的表达改变。
随着上皮细胞的恶性转化，HERVH的转录水平逐渐升高，提示HERVH可能是GBC早期诊断的潜在生物标志物。HHLA2是一种新兴的免疫检查点，由HERVH衍生而来，与HERVH表现出表达相关性，被认为是一种有前景的免疫治疗靶点。
研究技术
ScRNA-seq
研究结果
1. GBC中HERV的异常激活
为了研究GBC的细胞异质性和表征其分子特征，收集了4例GBC患者的肿瘤组织和匹配的正常组织进行scRNA-seq。经过qc过滤后，共获得28301个细胞，分为11种细胞类型，包括上皮细胞、B细胞、T细胞、NK或NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、DCs、中性粒细胞、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞。T细胞和上皮细胞是肿瘤和邻近正常组织中最丰富的细胞。上皮细胞、单核细胞和巨噬细胞主要富集于肿瘤组织中。
对GBC患者的HERV表达模式进行了表征，发现来自GBC组织的样本比来自邻近正常组织的样本具有更活跃的HERV位点和更高的HERV表达水平。肿瘤组织中HERVs的抑制意味着HERVs可能在GBC的起始和进展中发挥作用。此外，仅基于HERV表达的降维分析显示，具有相同细胞标签的细胞倾向于聚集在一起，这表明HERVs在肿瘤中以细胞类型特异性的方式积极转录。计算了每种细胞类型中所有HERV家族和HERV位点的差异表达，在癌症研究中，HERVE、HERVK和HERVH等家族主要在上皮细胞中表达。
Fig 1. GBC及邻近正常组织的单细胞景观和HERV表达模式
2. HERVs作为增强子可能调节邻近的DEGs
对于除NK/NKT细胞外的所有细胞类型，与邻近正常组织相比，HERVs在肿瘤中被广泛激活，而HERVs在上皮细胞中表达水平最高。与来自邻近正常组织的T细胞中只有4个HERV位点显著增加，而GBC衍生的树突状细胞中只有5个HERV位点显著增加。对于每一种细胞类型，由HERVs位点显著升高引起的增量只占所有HERVs引起的总增量的一小部分，这表明研究人员也应该考虑未通过截止点的HERV位点。这也提醒要在位点水平和家族水平上探索HERV在GBC中的异常表达。
HERV作为影响宿主基因转录的调控元件已被许多研究证实。为了找到作为增强子驱动邻近DEGs表达的HERVs，使用上皮细胞的scRNA-seq数据结合其他信息数据来预测可能的联系挑出了这一对在来自GBC的上皮细胞中，HERV位点和邻近的DEGs均上调。然后，根据以下标准进行进一步的过滤：1)HERV和邻近的DEG在GBC来源的上皮细胞中共表达；2)通过基因学家数据库预定义的增强基因连接，预测调控元件之间的关联增强子和启动子）和基于多个信息源的靶基因；3) HERV区域显示增强子样签名，支持高DNase和H3K27ac和低H3K4me3信号。只要HERVs和相邻的DEGs符合上述任何两个标准，HERVs被认为是建模相邻DEGs表达的候选增强子。
选择了一些预测的HERVs，通过双荧光素酶报告基因分析来验证来自HERVs的基因组片段具有增强子活性。邻近基因，如UCA1、SEPHS2和DCTPP1，可能受HERV衍生增强子调控，已被报道在肿瘤增殖和转移中发挥致癌作用。
Fig 2. HERV衍生增强子预测
3. HERVH在上皮细胞中的表达随着上皮细胞的恶性转化而增加
为了区分GBC组织中的恶性上皮细胞和正常上皮细胞，以基质细胞为参考，推断了大规模的CNVs。将上皮细胞分亚群，CNV评分明显较高的亚群被鉴定为恶性细胞。在恶性转化的转录轨迹中，中期的Epi_EDN1（高）细胞和早期的Epi_EDN1（低）细胞证实了这些假设。肿瘤及邻近正常组织在不同的部位包含所有亚型。恶性细胞主要在肿瘤中被识别出来，而Epi_EDN1（低）细胞在邻近的正常组织中更为富集。
恶性细胞的HERVs表达水平最高。为了进一步探索HERVH的异常激活，构建了一个明确的恶性和非恶性上皮细胞的转录轨迹。在随着肿瘤进展而显示转录改变的HERVs中，HERVH家族的HERVH-int、LTR7Y和LTR7的意义最高，提示HERVH可能是一种早期GBC诊断的生物标志物。鉴定了在恶性细胞中与这些HERVH元件表达相关的基因。这些基因在与内质网靶向蛋白、粒细胞趋化性、细胞增殖和分化相关方面高度富集。这些基因表达的改变可能是由HERVH的抑制引起的
HERVs在免疫治疗中被高度重视，如免疫检查点抑制剂，因为它们能够使肿瘤细胞对免疫识别敏感。HHLA2是一种最近出现的免疫检查点，被认为是由HERVH衍生出来的。HHLA2被认为在致癌过程中起双重作用：一种用于免疫刺激，另一种用于免疫抑制。检测了上皮细胞亚型中HHLA2的转录，以及肿瘤细胞中可能表达的一些免疫检查点。HHLA2在Epi_EDN1（高）（代表ICS）和恶性细胞中均有表达，且高于PD-L1（CD274），这是研究最多的免疫检查点。PD-L1转录的弱信号可能至少部分解释了针对PD-L1的免疫治疗在一些GBC患者中的有限疗效有限。HHLA2在中间细胞和恶性细胞中表达水平的升高及其在癌变中的双重作用（一种免疫刺激，另一种免疫抑制）提示HHLA2可能是GBC治疗的良好候选药物。此外，我们发现了HHLA2和HERVH元件的表达相关性，这意味着将旨在诱导HERVH激活的DNA去甲基化剂与靶向HHLA2治疗相结合可能是一种很有前途的治疗策略。
Fig 3. 恶性转化过程中恶性细胞的鉴定及HERVH的抑制
4. 增殖T细胞显示出异常高的HERV表达
T细胞在TME中表现出细胞组成和功能状态的异质性。T细胞被进一步划分为7个不同的亚群。与邻近正常组织相比，肿瘤组织中naïve CD4+ T和CD4−/CD8−T细胞比例减少，增殖T和调节性/耗尽的CD4+ T细胞比例增加。更多的调节性/耗尽的CD4+ T细胞在肿瘤组织中积累，表明在肿瘤进展过程中从免疫激活到免疫抑制的变化。
HERVs在不同亚型的T细胞中均有不同水平的表达。将来自肿瘤组织的细胞与来自邻近正常组织的细胞进行比较时，除初始CD4+ T和CD4+ Th细胞外，所有T细胞亚型中均观察到显著的HERV转录变化。HERVH相关元件、LTR13A、MER41B、LTR12C和MLT1D在来自肿瘤组织的增殖T细胞中表达上调。与HERVH上调相关相关基因与T细胞活化相关。
此外，在肿瘤组织中也检测到HERVH在调节/耗尽CD4+ T细胞中高表达，在CD8+ T GZMB和LTR7Y和CT在CD4−/CD8−T细胞中高表达。
Fig 4. 增殖性T细胞显示HERVs的显著表达水平
5. 血浆B细胞中IgG基因与MLT1C位点的关联
浸润TME的B细胞在调节肿瘤免疫中发挥着多方面的作用。B细胞亚型鉴定出三种主要的细胞亚群。这些B细胞亚群的组成在GBC和正常样本之间是不同的。在GBC中，浆细胞的相对比例增加，而滤泡B细胞在正常样本中富集，并在邻近正常组织中占B细胞的大部分。直接比较各B细胞亚型在GBC和正常组织中HERVs的表达水平，发现肿瘤来源的滤泡B细胞和血浆B细胞表现出HERV转录丰度的增加。与非肿瘤来源的滤泡B细胞相比，肿瘤细胞中HERVH-int和MSTC的表达水平更高。浆B细胞是终末分化的B细胞，可以分泌抗体，是其重要组成部分。发现了一个MLT1C位点与邻近的IgG基之间的转录关。这两种基因的表达关联和上调可以推测MLT1C-dup586-chr14可能是促进这些邻近IgG基因表达的调控因子。
Fig 5. IgG基因与血浆B细胞中邻近的MLT1C位点相关
6. HERVH在所有髓系细胞类型中的过表达
髓系细胞被分为单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞。根据突出的表达标记物进一步分为常规DC（cDC1和cDC2）、单核细胞来源的DC（mo-DC）和成熟DC。对于肿瘤和邻近组织，cDC2和mo-DC占树突状细胞的大多数，mo-DC和成熟的DC在GBC组织中富集，而cDC1s和cDC2s则被耗尽。不同DC亚型间的HERV表达模式有所不同。GBC中cdc1和mo-树突状细胞HERV的表达显著升高，而cdc2和成熟树突状细胞的表达无显著差异。Mo-DCs被认为是来自于炎症或感染背景下的单核细胞，该亚群可以在各种肿瘤模型中诱导T细胞激活。LTR7Y在来自GBC组织的mo-DCs中过表达。在mo-DCs中与LTR7Y表达模式相似的基因主要与抗病毒应答和T细胞活化有关，提示mo-DCs抗病毒和炎症能力的增强可能受到LTR7Y的调控。
此外，LTR7Y与MMP7基因表现出很强的相关性，MMP7作为一种致癌因子介导几种癌症的发生和进展。这种关联也在恶性细胞、增殖T细胞、T细胞和巨噬细胞中可见。在其他髓系细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中也观察到HERVH元素的表达显著增加。综上所述，HERVH元素在几乎所有的髓系细胞类型中都表达上调，它们可能对髓系细胞的行为和功能有类似的影响。
Fig.6 髓系细胞中HERVH的活化
7. MER65-int在成纤维细胞中被激活，并与ECM基因有表达相关性
肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤间质中最主要的组成部分之一，具有异质性的表型和功能。成纤维细胞分成了2种主要不同的亚型，包括炎症性CAFs（iCAFs；FDGFRA）和肌癌相关的成纤维细胞（myoCAFs；RGS5）。在GBC组织和邻近正常组织中，iCAFs是主要的细胞类型。与正常组织相比，GBC组织中myoCAFs的比例增加，而iCAFs的水平略有下降。在HERV的表达水平方面，肿瘤中iCAFs和myoCAFs均显著升高。筛选了GBC中异常激活的HERV。对于iCAFs，MER65-int、MER4D0和MER4- int是上调最多的HERV。在位点水平上，MER65-int-dup5-chr19在iCAFs中与其邻近基因CEACAM5相关。CEACAM5编码癌胚抗原（CEA），已被用作临床检测的肿瘤生物标志物。在GBC-来源的巨噬细胞中也观察到了这种关。对于myoCAFs，在GBC来源的细胞中特异性激活的MER65-int显示出与ECM组织相关的基因的相关性。这表明活跃的MER65-int可能参与了ECM基因的失调。在来自GBC组织的内皮细胞中，MER50、LTR7C、LTR6A和MLT1A0表达上调。然而，这些HERV家族如何影响细胞功能尚不清楚。
Fig 7. MER65-int在成纤维细胞中的活化
参考文献：
Wang J, Ren M, Yu J, Hu M, Wang X, Ma W, Jiang X, Cui J. Single-cell RNA sequencing highlights the functional role of human endogenous retroviruses in gallbladder cancer. EBioMedicine. 2022 Nov;85:104319. doi: 10.1016/j.ebiom.2022.104319IF: 11.1 Q1 . Epub 2022 Oct 29. PMID: 36374772IF: 11.1 Q1 ; PMCID: PMC9626538IF: 11.1 Q1 .