文章标题：Integrated Proteomics and Metabolomics Analysis of Nitrogen System Regulation on Soybean Plant Nodulation and Nitrogen Fixation

发表期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES

发表时间：2022.2

影响因子：5.923

合作客户：东北农业大学农学院

百趣生物提供服务：蛋白质组学分析和代谢组学分析

1、研究背景

大豆产量取决于根瘤固氮和氮施肥的综合作用，而大豆根系暴露于高浓度氮条件下，可抑制根瘤生长，加速根瘤衰老，降低固氮的效率。氮影响豆科作物结瘤和固氮的具体机制尚不清楚。为研究大豆中氮、结瘤与固氮的关系，采用嫁接法制备了单侧结瘤的双根大豆植株。在第3个三叶(V3)至第4个三叶(V4)生长期(5天)，向非结瘤侧添加氮营养液，在结瘤侧添加无氮营养液。百趣解读，本实验旨在研究外源氮对大豆根瘤中蛋白质和代谢物的影响，为分析大豆根瘤中施氮与固氮相互作用的生理机制。

2、研究结果

在V3期前，在大豆幼苗两侧加入氮素浓度为25mg/L(**铵浓度为71.4mg/L)的营养液进行培养。从V3期到V4期(为期5天)，将幼苗分为有氮处理或无氮处理的两组。氮处理组在未结瘤根中加入氮浓度为100mg/L(**铵浓度为285.6mg/L)的营养液，在结瘤根中加入无氮营养液，记录为NH。在无氮组的两侧加入无氮营养液，记录为NF

氮供应对结节生长和固氮酶活性的影响

百趣解读，通过对不同处理NH和NF向未结瘤的侧根供氮5天后，了解在结瘤的侧根上的根瘤数量和重量，5天供氮对根瘤的生长发育无显著影响(表1)。图1显示了氮供应对双根大豆根瘤中固氮酶活性的影响。向非结瘤侧根供氮后，与NF处理相比，NH处理其结瘤侧的特定固氮酶活性(SNA)和乙炔还原活性(ARA)分别降低了44.0%和41.0%，说明向非结瘤侧根供氮5天对结瘤侧根瘤的ARA和SNA有显著影响。

表1. 双根大豆根瘤数和干重的变化

图1. 大豆双根根瘤的固氮酶活性研究

大豆结节的蛋白质组学分析

通过分析了氮供应处理和对照之间的蛋白质组学变化，共鉴定出8573个蛋白，其中5279个蛋白属于甘氨酸（大豆），3294个蛋白属于日本慢生根瘤菌。按照治疗组间的差异表达蛋白(DEPs)采用FC>1.2或FC<0.83，p值<0.05为标准，共鉴定出164个DEPs。

百趣解读，利用GO数据库进行注释，研究了上述DEPs的功能。根据功能特征，DEPs属于与细胞组分(CC)、分子功能(MF)和生物过程(BP)相关的三组。CC组大豆根瘤组织的DEPs多富集于淀粉质体、内质网、内膜系统、膜蛋白复合物等中。MF组中的DEPs主要富含糖原（淀粉）合酶活性、辅助因子结合、血红素结合、四吡咯结合成分等。BP组主要富含淀粉生物合成过程、蛋白质退出内质网、淀粉代谢过程等（图2）。这些结果表明，氮处理可以调节大豆根瘤组织的碳代谢和氮代谢，从而影响大豆根瘤的固氮能力。

百趣生物解读，CC组大豆根瘤菌的DEPs多富集于细胞质、非膜结合细胞器、含蛋白复合物等中。MF组的DEPs主要富集于固氮酶活性、氧化还原酶活性等。BP组主要富集于固氮、氮循环代谢过程、有机氮化合物生物合成过程、细胞氮化合物代谢过程等（图3）。结果表明大豆根瘤菌与根瘤组织的结果相同，根瘤菌中大部分差异蛋白在氮和碳代谢过程中富集。

图2. 大豆结节组织中差异表达蛋白（DEPs）的GO注释统计

图3. 大豆根瘤菌中差异表达蛋白（DEPs）的GO注释统计

利用(KEGG)通路分析，探索所鉴定的DEPs可能参与的代谢或信号通路。如图4所示，大豆根瘤组织中的DEPs主要参与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、叶酸、倍半萜和三萜生物合成、C5-支二酸代谢和内质网中的蛋白质加工。如图5所示，大豆根瘤菌中的DEPs主要参与碳代谢、氮代谢、光合生物中的固碳作用、叶酸生物合成、果糖和甘露糖代谢、核糖体等方面。

图4. 大豆根瘤组织中DEPs的KEGG通路

图5. 大豆根瘤菌中DEPs的KEGG通路

大豆结节的代谢组学分析

百趣解读，通过分析氮供应处理和对照之间的代谢组学方法测定大豆根瘤代谢谱的变化。治疗组间的差异表达代谢物(DEMs)采用VIP>1，p值<0.05为标准，共鉴定出56种差异表达代谢物(DEMs)，其中上调20个，下调36个。利用代谢组学(KEGG)通路分析，探索富含差异代谢物的代谢组学代谢途径。DEMs主要富集于代谢途径、次生代谢产物的生物合成、氨基酸生物合成、磷酸戊糖途径、碳代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等方面。

图6. 差异代谢物富含的KEGG通路分析

结合蛋白质组学和代谢组学分析治疗组之间的DEPS和DEMs进行综合KEGG途径分析

百趣解读，大豆根瘤组织中的KEGG途径如图7所示，这些途径包括代谢组学代谢途径、次级代谢产物的生物合成、内质网中的蛋白质加工、碳代谢、ABC转运体、核糖体、氨基酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢等。大豆根瘤菌中的KEGG途径如图8所示，代谢途径包括次级代谢产物的生物合成、异种抗生素的生物合成、叶酸生物合成等。

根瘤中的碳代谢是固氮的主要能量来源，蔗糖可通过淀粉合酶(StS)转化为淀粉储存，并通过蔗糖合酶(SS)催化转化为UDP-葡萄糖和果糖为根瘤内固氮提供能量。氮的供应降低了精氨酸的浓度，而增加腐胺和ODC(A0A0A3Z5A3)的表达，研究表明腐胺、一氧化氮(NO)和天冬酰胺是调节根瘤固氮的信号分子(图9)。在本研究中，通过比较治疗间大豆，氮调控淀粉和蔗糖代谢、有机酸代谢、硫代谢、氮代谢、氨基酸代谢等代谢途径。

图7. 大豆结节组织中同时涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

图8. 大豆根瘤菌中同时涉及DEPs和DEMs的KEGG通路

图9. DEPs和DEMs与结节中氮调控途径

3、结论

通过比较氮处理和不氮处理大豆，氮调控淀粉和蔗糖代谢、有机酸代谢、硫代谢、氮代谢、氨基酸代谢等代谢途径。此外，外源氮促进了根瘤中腐胺、一氧化氮和天冬酰胺的合成，抑制了蔗糖向苹果酸的转化；因此，根瘤菌缺乏固氮能量。此外，外源氮降低了根瘤细胞壁的合成，从而抑制了根瘤的生长和固氮。

文/阿趣代谢组学